维生素是动植物体的生长发育所必需的微量营养素，包括A,B1,B2,B3,B5,B6,B8,B9,B12,C,D,E,K。这些物质由于人体内不能合成或合成量不足，所以虽然需要量很少，但必须从膳食中获得。因此，利用现代生物技术来提高植物合成的维生素含量可以比较有效地应对全球性维生素缺乏的问题，对人类的生存与健康具有重要意义。   

　　本文综述了近年来国内外植物中维生素代谢和生物强化的主要研究成果，并对利用分子设计育种来进行维生素生物强化的未来发展方向进行了展望。 

　　维生素对人类的重要性 

　　维生素（Vitamin）是指人体不可缺少、必须通过膳食来获得的小分子化合物，对预防营养缺乏性疾病非常重要。目前确认的人体必需维生素有四种脂溶性维生素（维生素A、D、E、K）和九种水溶性维生素（维生素B1、B2、B3、B5、B6、B8、B9、B12和维生素C）。人体可以合成维生素D和维生素B12，不过还不足以满足人体的需求；其余的维生素虽然不能在人体内合成，但可以在细菌、真菌和植物中合成并积累，而且这些维生素也是这些物种生长发育必需的微量营养物质。 

　　维生素通常作为酶学反应的催化剂、辅酶或者辅酶的一部分，对人体和植物的生长发育起重要作用。在人体中维生素的缺乏通常引起营养性疾病，如脚气病（维生素B1，硫胺焦磷酸）、糙皮病（维生素B3，烟酸）、贫血（维生素B6，吡哆醛）、坏血症（维生素C，抗坏血酸）和软骨病（维生素D）。同时，叶酸摄取不足会引发巨幼红细胞贫血和胎儿神经管发育缺陷，维生素A的缺乏导致全球有上亿的儿童有失明和易感疾病的危险，而维生素K的缺乏可以导致中风风险的增加。 

　　为了减少营养缺乏疾病发生的风险，在发达国家中的人们可以通过食物中添加人工维生素或增加膳食的丰富性，但在发展中国家，数以亿计的人们由于饥饿和营养不良导致了维生素与矿物质的多重营养缺乏症。近些年人们通过对慢性疾病（如心血管疾病、癌症、糖尿病、肥胖、骨质疏松和牙周炎）的成因的了解，发现植物性膳食不仅满足了温饱，更重要的是为人体提供必需营养素、防止营养缺乏造成的疾病，同时还提高了人们的生活水平。因此，利用现代农业生物技术来提高植物合成的维生素含量可以比较有效地应对全球性维生素缺乏的问题，对人类的生存与健康具有重要意义。

　　维生素代谢的复杂性 

　　维生素在各个物种中通常作为催化剂、辅酶或者辅酶的一部分参与酶学反应，此外人体中维生素C和E还具有抗氧化的作用，β-胡萝卜素与维生素D在动物血液中一起参与钙和磷的动态平衡。 

　　除了维生素D和维生素K之外，人类自身不能制造其他任何一种我们必需的维生素，但其原因只在少数维生素中被研究过。例如，人类由于L-古洛糖酸内酯氧化酶基因发生了严重突变，导致无法合成GULO酶，也就无法制造维生素C；人体中也缺乏有功能的二氢新蝶呤醛缩酶、二氢蝶呤羟甲基焦磷酸激酶/二氢蝶呤合成酶、分支酸合成酶、分支酸裂解酶和二氢叶酸合成酶，而导致必须从膳食中摄取叶酸。 

　　因此，为了应对全球性维生素缺乏的问题，科学家在植物维生素代谢方面开展了许多工作。一方面，植物维生素代谢得到更多的阐释，关键酶基因不断被克隆；另一方面，人们利用获得的植物维生素的新知识，不断探讨如何将传统育种和分子育种结合以通过获得高品质的植物来源的天然维生素来有效应对全球性维生素缺乏的问题。 

　　目前，已经对各类维生素在植物器官水平和亚细胞水平的储存位置有了比较清楚的了解：β-胡萝卜素主要在叶片和胡萝卜的块茎中富集；α-胡萝卜素富集在果实和胡萝卜的块茎中；β-玉米黄质主要在果实、种子和花中富集；这些维生素A前体都储存在有色质体中。B族维生素主要聚焦在种子中，在细胞质、叶绿体和线粒体中都存在；种皮中维生素B1和维生素B3的含量尤其高。 

　　维生素C主要贮存在果实中，位于叶绿体、非原质体、细胞质和液泡中。维生素E主要在油类作物的种子中富集，位于叶绿体和脂质体中；所有绿色蔬菜和胡萝卜中都含有叶绿醌（维生素K1），主要存在于叶绿体和质膜上。 

　　同时研究发现，植物维生素代谢网络具有一些共性：首先，多种维生素的合成有着共同的碳水化合物来源；第二，多种维生素的合成具有共同的中间产物；第三，维生素合成的关键反应中必需有其他维生素的参与；第四，氨基酸代谢与维生素代谢密切相关联。 

　　由于这种网络内的代谢复杂性，改变一条维生素代谢通路常常伴随着其他维生素代谢通路的协同反应，例如在土豆块茎中过表达玉米黄质环氧化酶会导致玉米黄素和生育酚的含量同时增加；拟南芥中过表达生育酚环化酶基因使δ-生育酚含量增加几倍，而维生素C含量却减少60%。 

　　这种调控机制可能是代谢底物的利用效率改变，也可能是产物对酶学反应的反馈抑制，还有可能是维生素小分子与基因的mRNA直接发生的核开关调控，上述可能性都非常值得探讨。这些新知识的获得都为人们在植物中进行维生素强化打下了深厚的研究基础。 

　　维生素A在植物中的生物强化进展 

　　目前维生素生物强化通常采用以下四种策略：1）增强限速步骤的酶活性；2）过表达反应的第一步；3）抑制代谢支路；4）增加代谢物储藏空间。下面将分别介绍植物中各类维生素生物强化的研究进展。 

　　维生素A 

　　维生素A是类视黄酮的总称，蔬果中的维生素A前体（类胡萝卜素）可以在人体内转化为维生素A。类胡萝卜素广泛存在于蔬果中，如橙子、西兰花、菠菜、胡萝卜、南瓜等；土豆、大麦和小麦中含量低；而在水稻和小米中很难被检测到。植物中的类胡萝卜素有4类：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和β-核黄素。 

　　目前作物种维生素A前体的生物强化中的重大突破就是黄金大米。当八氢番茄红素去饱和酶在植物体内的过表达可以导致类胡萝卜素的含量明显提高。其中第二代黄金稻米的类胡萝卜素含量高达37微克/克，而且84%为β-胡萝卜素。目前临床试验表明第二代黄金稻米中的β-胡萝卜素能有效地转化为视黄醇，是一种不错的维生素A源。类似的策略在油菜籽、胡麻籽、土豆、番茄、玉米和大豆中都获得了成功。 

　　最新的报道显示，使用基因枪技术将融合了来自豌豆的叶绿体定位信号和菠萝泛素的八氢番茄红素合成酶基因crtB转化大豆时，其种子中的β-胡萝卜素提高了1500倍。 

　　此外，还有其他两种提高类胡萝卜素含量的方法：1）抑制番茄红素环化酶和β-胡萝卜素羟化酶基因的转录水平使得代谢流朝形成β-胡萝卜素的方向进行，这个策略在土豆、红薯和小麦中得到成功应用；2）调节橙色基因的活性。Or基因在橙色果肉的红薯中负责类胡萝卜素的积累，而且Or蛋白与PSY蛋白物理互作，可以在翻译后水平上增加PSY蛋白的稳定性和活性。这个策略在红薯、土豆、花菜和番茄中均获得成功。 

　　不过上述策略也有不足之处。例如在番茄中类胡萝卜素基因过表达时，种子的核黄素、β-胡萝卜素和玉米黄质的含量有所增加，但伴随着赤霉素含量的减少，导致植株的矮化。因此，代谢工程育种会受到人们对内源代谢调控和基因表达的时空差异了解有限的影响。因此，如果能利用全基因组关联分析来确认更多的天然等位变异，可以通过等位基因聚合协助维生素A原的强化。 

　　由于玉米的遗传多样性，通过GWAS来明确调控类胡萝卜素含量积累的工作主要在玉米中开展。目前了解到PSY的转录水平与类胡萝卜素的含量有正相关性，而编码类胡萝卜素的基因、编码玉米黄质氧化酶基因与类胡萝卜素的含量呈负相关。此外通过数量性状遗传位点发现很多参与类胡萝卜素代谢的基因的优良等位变异与β-胡萝卜素含量密切相关。这意味着如果通过天然变异找到合适的供体亲本可以加速维生素A前体的生物强化。目前，利用分子辅助育种技术已经分别了获得了富含β-胡萝卜素的大田玉米和富含玉米黄质的甜玉米。 

　　而在水稻中的最新研究表明，在黄金大米2号的基础上的多基因策略可以使胚乳中总类胡萝卜素的含量比之前还可以提高6倍。这个策略中分别表达了2个不同的酶：1）拟南芥来源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，它在赤藓醇磷酸合出途径中可以生成类胡萝卜素的前体，说明类异戊二烯的底物增加可以导致最终产物的增加；2）拟南芥来源的橙色基因，这个基因的导入可以使胚乳中储藏类胡萝卜素的空间增大。 

　　上述结果表明，确认代谢途径的瓶颈可以精确调整生物强化的策略，获得具有特定类胡萝卜素图谱的转基因材料。 

　　叶酸 

　　叶酸是一种非常重要的水溶性B族维生素，包括四氢叶酸及其一系列衍生物。它作为一碳单位的供体参与很多代谢反应。细菌、真菌和植物都可以合成叶酸，细菌和真菌都是在细胞质中合成叶酸，而植物中的叶酸分别在细胞质、线粒体和质体中合成。 

　　在番茄、水稻、玉米、生菜、土豆和墨西哥豆中都进行过生物强化。一般有两种策略：1）过表达叶酸合成的限速酶DHFS，在玉米中过表达可以使叶酸有2倍的提高；2）过表达叶酸合成支路的第一步反应酶。例如，过表达细胞质中的GTP环化酶可以使番茄中叶酸含量提高2倍、生菜中提高8.5倍，墨西哥豆中提高150倍。如果与ADCS的转基因植株杂交，土豆中叶酸中含量为原来的3倍、番茄为原来的25倍、水稻中为原来的100倍。 

　　此外有报道指出，拟南芥来源的叶酰谷氨酸聚合酶和哺乳动物来源的叶酸结合蛋白在叶酸强化的水稻中过表达可以增加叶酸的储藏稳定性。而且叶酸强化的番茄和水稻也被证实可以提高人们体内的叶酸含量。上述结果说明对叶酸代谢的更好的理解可以针对作物进行更有效的叶酸强化。 

　　其他B族维生素 

　　其他B族维生素包括维生素B1（硫胺素类化合物）、维生素B2（核黄素类化合物）、维生素B3（烟酸）、维生素B5（泛素）、维生素B6（吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺及其磷酸化的衍生物）、维生素B7（生物素）和维生素B12（钴胺素）。 

　　截至目前，只在拟南芥中的维生素B1和维生素B6的含量进行过过表达。在维生素B1途径中磷酸甲基嘧啶合成酶过表达后可以使硫胺素类化合物的含量有一个中度的提高，但这种维生素B1的动态平衡能否在作物中实现还很难说。维生素B6是一大组水溶性的同效维生素，其中磷酸吡哆醛是超过140个细胞内酶学反应的辅酶，是主要的有效形式。近几年，有几个研究小组在拟南芥中过表达了吡哆醛磷酸合成酶基因，但效果还不是非常明显。上述结果说明人们需要增加B族维生素在植物体内调控机制的研究，才能进一步明确其在植物中生物强化的策略。 

　　维生素C 

　　维生素C又名抗坏血酸，在植物中主要有多条途径来生成维生素C，其中葡萄糖-6-磷酸是Smirnoff-Wheeler途径的底物、半乳糖醛酸是果胶降解途径的底物、肌醇是类动物途径的底物。 

　　目前对植物维生素C含量的改良策略有三种：1）提高合成途径关键酶基因的表达水平；2）促进维生素C的再生循环，提高还原抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的比例；3）利用转录因子整体强化维生素C的代谢途径。在利用维生素C合成途径和再循环利用途径的关键基因后，番茄、土豆、玉米和草莓中都已经进行过维生素C的生物强化。使用过的基因分别编码GDP-甘露糖焦磷酸化酶、阿拉伯糖内酯氧化酶、肌醇加氧酶2、GDP-甘露糖差相异构酶、半乳糖醛酸还原酶、L-古洛糖酸内酯氧化酶和GDP-L-半乳糖磷酸化酶。其中目前发现能使维生素C含量提高最有效的是GGP的过表达，能使猕猴桃的维生素C含量提高4倍，如果GGP和GME一起在烟草中共表达，其叶片的维生素C含量可以提高到12倍。 

　　在第二个策略的应用中，降低单脱氢抗坏血酸还原酶的转录水平可以使番茄中的抗坏血酸含量增加；在玉米和土豆中过表达脱氢抗坏血酸还原酶可以使植物的叶片、籽粒和块茎中的抗坏血酸含量明显增加。在第三个策略的应用中发现过表达拟南芥中转录因子AtERF98可以使甘露糖/半乳糖途径中的许多关键基因和肌醇合成途径的MIOX4转录水平升高进而导致抗坏血酸含量的增加。但维生素C的生物强化在主要粮食作物上的应用鲜见报道。 

　　维生素E 

　　维生素E对人类的膳食和健康都非常重要，外源的维生素E通过肝脏吸收。植物是人类维生素E摄入的主要来源。维生素E包括生育酚和生育三烯酸，其中生育三烯酸是大多数单子叶植物和一部分双子叶植物的主要维生素E形式。在各类维生素E化合物中，α-生育酚可以被人类的α-生育酚转运蛋白协助，因此维生素E的生物强化主要指提高总的含量和α-生育酚所占比例。 

　　维生素E的生物强化主要集中在种子中进行，其目标是提高维生素E的总量和改变维生素E各组分的比例，并将其他种类的生育酚类物质都转化为维生素E活性最高的α-生育酚。 

　　具体维生素E的生物强化的策略主要有两种：1）单基因；2）多基因。在油菜、烟草、生菜、番茄、大麦、水稻、大豆和玉米中都已经进行过维生素E的生物强化，使用过的基因分别编码生育酚环化酶、羟苯丙酮酸双加氧酶、尿黑酸植基转移酶、2-甲苯-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶、尿黑酸牛儿基牻牛儿基转移酶和γ-生育酚甲基转移酶。 

　　其中，最成功的转单基因应用是花椰菜35s启动子驱动的γ-TMT在植物里的过表达，植物种子中的α-生育酚的比例都得到了显著提高，例如油菜中增加了6倍、轮叶党参中增加了6.4倍、生菜中增加了2倍、紫苏中增加了1.8倍、大豆中增加了4倍，拟南芥中增加了80倍。 

　　同时过表达多个基因可以使维生素E的含量得到巨大提高，同时明显增加了α-生育酚的比例。油菜中同时过表达HPT和γ-TMT可以使维生素E的活性提高12倍，同时几乎所有γ-和δ-生育酚都转化为α-和β-生育酚。MT（VTE3）可以使大豆中的生育三烯酸比例由20%降低到2%，当与γ-TMT结合在一起过表达时，种子聚集的α-生育酚占比高达95%，α-生育酚的含量增加了至少8倍，种子维生素E的活性增加了最高5倍。酵母中的tyrA（编码HPT）,拟南芥HPPD和HPT在大豆中过表达时，尿黑酸和生育酚的在种子中的含量分别增加了800和15倍，维生素E的活性相对野生型增加了11倍；烟草中使用同样的策略时叶片总维生素E含量提到了约10倍。 

　　不过，在玉米中过表达拟南芥HPPD和MT后籽粒中只有γ-生育酚的含量增加了3倍，其他形式的维生素E都没有被检测到；而土豆中使用过表达拟南芥的HPPD或HPT都无法使生育酚的比例发生任何变化。此外人们还尝试用人工合成的转录调控影子使拟南芥的α-生育酚的含量增加了20倍。GWAS也在玉米中确认了MT和γ-TMT的多个优良等位位点与维生素E的含量密切相关。 

　　这些结果说明如果对植物的维生素E代谢调控有了进一步了解，可能可以确定更多的适宜生物强化的候选基因。

　　未来展望 

　　联合国粮农组织表示，更多地建设以食物为基础的营养型农业能够减少人体微量营养元素缺乏的状况。人们被鼓励按自己所好通过增加膳食的种类、改变生活方式和增加运动来增加微量营养元素的摄入，不过目前这些策略因为经济和技术的困难还有待进一步推广。 

　　此外也有报道膳食中过量添加的人工叶酸能影响人类的DNA甲基化水平，进而与患结肠癌和前列腺癌的几率有所关联。因此通过增加摄入富含维生素的作物非常具有应用前景。最近的报道显示在发达国家（德国、英国、芬兰和美国）人群的维生素的摄入仍旧低于推荐水平，这说明尽管有丰富的食品可供选择，人体对维生素的需求和实际的获得上仍存着这巨大缺口。目前最成功的植物维生素生物强化是富含维生素A前体和叶酸的水稻。 

　　转基因技术对于维生素A前体的生物强化是非常有效的，在多个物种中都非常成功，例如油菜籽、胡麻籽、土豆、番茄、玉米和大豆。同时自然变异的作物群体也为人类通过分子辅助选育富含维生素A前体、叶酸和维生素E提供了大量的候选基因。特别是目前已经有多个研究表明维生素生物强化的粮食作物可以正面影响人体的营养和健康。而且很多生物强化的食物不需要蒸煮就可以被人们使用，例如富含花青素、类胡萝卜素、叶酸的番茄和富含lycopene、zeaxanthin的甜玉米。不过到目前为止，还没有更好地可以用于维生素B1、维生素B6和维生素C的策略。如果未来能将遗传网络、生化功能、分子机理有机地结合在一起，并借助同位素标记的代谢组学,代谢产物与大分子的互作和代谢产物与小分子互作等技术手段来进一步理解植物维生素代谢调控的过程，则未来的植物维生素生物强化将很有前景。 

　　由于维生素是人体必需的微量营养元素，未来针对植物的维生素生物强化可以考虑针对人体的个性化需求生产个性化的生物强化植物：1）通过全基因组测序将建立作物的营养单倍型，进一步了解性状形成的遗传机制;2）通过大数据的挖掘确认与营养相关的表型，结合代谢组和GWAS明确作物的优良等位变异;3）通过代谢组学技术明确维生素代谢的中间产物和反应的限速步骤;4）明确涉及特定的转基因策略和途径。最终，维生素生物强化的植物能满足人们对营养的个性化需求，并提高人们的健康水平。 

　　作者单位：中国农业科学院生物技术研究所